Nou procés fermentatiu per a la biosíntesi de vitamina B12

La vitamina B_12, també coneguda com cobalamina (Cbl), és una vitamina hidrosoluble i essencial per a molts organismes. La seva existència es va començar a teoritzar com un hipotètic ‘factor intrínsec’ capaç de curar i prevenir l’anèmia perniciosa, però no va ser fins a 1948 quan va ser identificada i aïllada per primera vegada. És una molècula complexa de gran importància fisiològica, que actua com a coenzim en diverses rutes metabòliques essencials en humans. L’ésser humà no és capaç de sintetitzar aquesta vitamina i, per tant, ha d’adquirir-la mitjançant la ingesta d’aliments d’origen animal, com carn, peix i marisc, llet, derivats làctics i ous. Com que aquesta vitamina no és present en aliments d’origen vegetal, les persones que segueixen dietes veganes o vegetarianes necessiten ingerir suplements de vitamina B₁₂. Malgrat que la seva síntesi química està totalment elucidada, a causa de la seva complexitat i baixos rendiments la fermentació amb microorganismes amb una elevada capacitat de producció és el mètode escollit per a la producció industrial de vitamina B₁₂, principalment mitjançant soques aeròbiques del gènere Pseudomonas, o anaeròbioques del gènere Propionibacterium.

En el Grup de Química Biològica i Biotecnologia – GQBB d’IQS, i en col·laboració amb l’empresa HealthTech BioActives – HTBA, especialitzada en la producció de derivats de vitamina B₁₂, el Dr. Álvaro Calvillo ha dut a terme la seva tesi doctoral centrada en l’optimització del creixement d’una soca wild type de Propionibacterium freudenreichii subs shermanii: NBRC 12391, per a la millora de la producció de vitamina B₁₂, mitjançant aquest microorganisme anaeròbic. Amb el títol “Industrial Production of Vitamin B₁₂ with Propionibacterium freudenreichii subs shermanii“, la tesi ha estat codirigida pel Dr. Antoni Planas i el Dr. Marc Carnicer, del Departament de Bioenginyeria d’IQS i integrants del grup de recerca GQBB, i cotutelada per la Dra. Teresa Pellicer de l’empresa HTBA.

Un nou procés per a la producció industrial anaeròbica de vitamina B₁₂

La principal via de producció industrial de vitamina B₁₂ és mitjançant soques aeròbies modificades tipus salvatge o modificades genèticament, p.e. Pseudomonas denitrificans. En el passat, també es van fer servir soques de Propionibacterium resistents a l’àcid propiònic, obtingudes mitjançant mutagènesi aleatòria. La recerca del Dr. Calvillo es va centrar en l’ús d’una soca wild type de Propionibacterium freudenreichii subs shermanii: NBRC 12391. Malgrat la seva menor producció, el principal avantatge de Propionibacterium, davant altres soques aeròbies, és que es tracta d’un organisme GRAS (Generally Recognized as Safe) . A més, en el cas d’aquesta tesi, i per la gran consciència sobre la salut i l’ecologia del sector de mercat al qual solen anar destinats aquest tipus de productes, es va decidir utilitzar un microorganisme wild type sense modificacions genètiques. Així doncs, aquesta recerca es va dur a terme a escala de desenvolupament de bioprocés, i per això la principal dificultat del projecte va ser desenvolupar una estratègia de cultiu viable, per tal de disminuir l’efecte inhibitori de l’àcid propiònic sobre el creixement i la producció.

La primera part de la tesi del Dr. Calvillo, una línia de recerca pionera en el grup GQBB, va consistir en la posada a punt d’una metodologia de cultiu robusta i fiable, incloent-hi l’estudi de la composició del medi, l’establiment de les condicions i metodologia per al cultiu d’organismes anaeròbics, les estratègies d’addició de suplements, les condicions de cultiu, la regulació del pH, etc. A més, es va implementar un procediment fiable d’extracció de cobalamina, així com un mètode analític basat en HPLC per a la identificació i quantificació d’aquesta. Un cop implementat el procés de cultiu amb èxit, el Dr. Calvillo va assajar diverses estratègies d’optimització del cultiu i de productivitat de la vitamina B₁₂, tenint en compte múltiples aspectes clau pel procés.

El següent pas va ser l’escalat en bioreactor assajant diverses estratègies, sent el bioprocés en continu en una sola fase anaeròbica (a diferència de les dues fases usualment descrites: anaeròbica pel creixement i microaeròbica per a la producció) el que va conduir a millors resultats. Aquesta darrera estratègia va permetre un augment notable de la productivitat, sense la dependència de configuracions complexes i evitant les dificultats relacionades amb la inhibició de l’àcid propiònic.

El nou mètode de cultiu establert en aquesta tesi, resultat del primer projecte amb aquests tipus de microorganismes en el grup GQBB, estableix una nova forma de producció de vitamina B₁₂ amb soques anaeròbiques no resistents a propiònic, que pot servir com a base per a continuar l’optimització del creixement i la producció de cobalamina a nivell bioprocés.

Publicacions relacionades

Álvaro Calvillo, Teresa Pellicer, Marc Carnicer, Antoni Planas, Developing a single-stage continous process strategy for vitamin B₁₂ production with Propionibacterium freudenreichii, Microbial Cell Factories 22, article number 26, 2023.

Álvaro Calvillo, Teresa Pellicer, Marc Carnicer, Antoni Planas, Bioprocess strategies for vitamin B₁₂ production by microbial fermentation and its market applications, Bioengineering 2022, 9(8), 365, 2022.

Aquesta tesi s’ha dut a terme dins del Pla de Doctorats Industrials de la Generalitat de Catalunya, en modalitat de cofinançament entre l’empresa HealthTech Bioactives i  IQS School of Engineering (Universitat Ramon Llull)