Nuevo proceso fermentativo para la biosíntesis de vitamina B12

La vitamina B_12, también conocida como cobalamina (Cbl), es una vitamina hidrosoluble y esencial para muchos organismos. Su existencia comenzó a teorizarse como un hipotético “factor intrínseco” capaz de curar y prevenir la anemia perniciosa, pero no fue hasta 1948 cuando fue identificada y aislada por primera vez. Es una molécula compleja de gran importancia fisiológica, que actúa como coenzima en varias vías metabólicas esenciales en humanos. El ser humano no es capaz de sintetizar esta vitamina y, por tanto, debe adquirirla a través de la ingesta de alimentos de origen animal, como carne, pescado y marisco, leche, derivados lácticos y huevos. Al no estar esta vitamina presente en alimentos de origen vegetal, las personas que siguen dietas veganas o vegetarianas necesitan ingerir suplementos de vitamina B₁₂. A pesar de que su síntesis química está completamente elucidada, debido a su complejidad y bajos rendimientos, la fermentación con microorganismos con una alta capacidad de producción es el método elegido para la producción industrial de la vitamina B₁₂, principalmente mediante cepas aerobias del género Pseudomonas o anaerobias del género Propionibacterium.

En el Grupo de Química Biológica y Biotecnológica – GQBB de IQS, y en colaboración con la empresa HealthTech BioActives – HTBA, especializada en la producción de derivados de vitamina B_12, el Dr. Álvaro Calvillo ha llevado a cabo su tesis doctoral centrada en la optimización del crecimiento de una cepa wild type de Propionibacterium freudenreichii subs shermanii: NBRC 12391, para la mejora de la producción de vitamina B₁₂ mediante este microorganismo anaeróbico. Con el título «Industrial Production of Vitamin B₁₂ with Propionibacterium freudenreichii subs shermanii«, la tesis ha sido codirigida por el Dr. Antoni Planas y el Dr. Marc Carnicer, del Departamento de BioIngeniería de IQS y miembros del grupo GQBB, y cotutelada por la Dra. Teresa Pellicer de la empresa HTBA.

Un nuevo proceso para la producción industrial anaeróbica de vitamina B₁₂

La principal vía de producción industrial actual de vitamina B₁₂ es a partir de cepas aerobias modificadas tipo salvaje o modificadas genéticamente, p.e. Pseudomonas denitrificans. En el pasado, también se emplearon cepas de Propionibacterium resistentes al ácido propiónico obtenidas mediante mutagénesis aleatoria. La investigación del Dr. Calvillo se centró en la utilización de una cepa wild type de Propionibacterium freudenreichii subs shermanii: NBRC 12391. A pesar de su menor producción, la principal ventaja de Propionibacterium frente a cepas aerobias es que es un organismo GRAS (Generally Recognized as Safe). Además, en el caso de esta tesis, y debido a la gran conciencia sobre la salud y la ecología del sector de mercado al que suelen ir destinados este tipo de productos, se decidió utilizar un microorganismo wild type sin modificaciones genéticas. Así pues, esta investigación se llevó a cabo a nivel de desarrollo de bioproceso, por lo cual la principal dificultad del proyecto fue desarrollar una estrategia de cultivo viable para disminuir el efecto inhibitorio del ácido propiónico sobre el crecimiento y la producción.

La primera parte de la tesis del Dr. Calvillo, una línea de investigación pionera en el grupo GQBB, consistió en la puesta a punto de una metodología de cultivo robusta y fiable, incluyendo el estudio de la composición del medio, el establecimiento de las condiciones y metodología para el cultivo de organismos anaeróbicos, las estrategias de adición de suplementos, las condiciones de cultivo, la regulación del pH, etc. Además, se implementó un procedimiento fiable de extracción de cobalamina, así como un método analítico basado en HPLC para la identificación y cuantificación de la misma. Una vez implementado el proceso de cultivo con éxito, el Dr. Calvillo ensayó diversas estrategias de optimización del crecimiento del cultivo y de productividad de la vitamina B₁₂, atendiendo a múltiples aspectos clave para el proceso.

El siguiente paso fue el escalado en biorreactor ensayando diversas estrategias, siendo el bioproceso en continuo en una sola fase anaeróbica (a diferencia de las dos fases usualmente descritas -anaeróbica para el crecimiento y microaeróbica para la producción-) el que condujo a mejores resultados. Esta última estrategia permitió un aumento notable de la productividad, sin tener que depender de configuraciones complejas y evitando las dificultades relacionadas con la inhibición del ácido propiónico.

El nuevo método de cultivo establecido en esta tesis, resultado del primer proyecto con este tipo de microorganismos en el grupo GQBB, establece una nueva forma de producción de vitamina B₁₂ con cepas anaeróbicas no resistentes a propiónico, que puede servir como base para continuar la optimización del crecimiento y la producción de cobalamina a nivel bioproceso.

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Álvaro Calvillo, Teresa Pellicer, Marc Carnicer, Antoni Planas, Developing a single-stage continous process strategy for vitamin B₁₂ production with Propionibacterium freudenreichii, Microbial Cell Factories 22, article number 26, 2023.

Álvaro Calvillo, Teresa Pellicer, Marc Carnicer, Antoni Planas, Bioprocess strategies for vitamin B₁₂ production by microbial fermentation and its market applications, Bioengineering 2022, 9(8), 365, 2022.

Esta tesis se ha llevado a cabo dentro del Plan de Doctorados Industriales de la Generalitat de Catalunya, en modalidad de cofinanciación entre la empresa HealthTech Bioactives e IQS School of Engineering (Universidad Ramón Llull)