Obtenció de HMOs per síntesi enzimàtica

La llet materna aporta nombrosos beneficis als nou nats, degut especialment als oligosacàrids coneguts com HMOs (sigles del seu nom en anglès Human Milk Oligosaccharides), amb diverses funcions biològiques que els fa actuar com prebiòtics, immunomoduladors o inhibidors de patògens, entre d’altres. Els HMOs estan presents en una composició única i molt variable, que aporta a la llet materna característiques pròpies i difícilment substituïbles.

A dia d’avui s’han identificat més de 200 estructures d’HMOs diferents, essent impossible la seva obtenció a partir de fonts naturals. A més, degut a la seva elevada complexitat estructural, la síntesi química a gran escala d’aquests carbohidrats segueix sent un repte, requerint de nombroses etapes sintètiques. Les llets de fórmula comercials contenen, així, només HMOs d’estructures simples. Per tant, un dels grans reptes en la producció d’aquests tipus de llets és aconseguir un producte amb propietats que mimetitzin el màxim possible amb la llet materna natural. La síntesi enzimàtica es presenta com a interessant alternativa sintètica per a la producció d’aquests compostos, ja que, gràcies als enzims, permet controlar l’estèreo i regioselectivitat de l’oligosacàrid format.  A més, és fàcil de transferir a procés industrial, essent una tecnologia neta i respectuosa amb el medi ambient.

En aquest context, la Dra. Mireia Castejón va defensar recentment la seva tesi doctoral realitzada al Departament de Bioenginyeria d’IQS School of Engineering, sota el títol ‘Oligosacàrids de la llet materna: un repte per a les llets de fórmula. Enginyeria de proteïnes de l’enzim lacto-N-biosidasa de Bifidobacterium bifidum per a la síntesi de lacto-N-tetraosa’. La tesi ha estat dirigida per la Dra. Magda Faijes, professora titular, i pel Dr. Antoni Planas, professor catedràtic, del Departament de Bioenginyeria, sent ambdós membres del Grup de Química Biològica i Biotecnològica (GQBB).

Síntesi enzimàtica de lacto-N-tetraosa

Un dels HMOs majoritari present a la llet materna és el tetrasacàrid lacto-N-tetraosa (LNT) i els seus derivats fucosilats i/o sialilats. El responsable de la seva hidròlisi per la microbiota en el tracte intestinal dels nou nats és l’enzim lacto-N-biosidasa de B. bifidum (LnbB), que pertany a la família GH20 de les glicosil hidrolases. En la seva recerca, la Dra. Castejón ha realitzat el redisseny del LnbB, a fi i efecte d’obtenir un biocatalitzador eficient per a la producció de la LNT per via enzimàtica.

Mitjançant l’estudi estructural dels subsetis negatius de l’enzim LnbB, s’han redissenyat aquests emprant mètodes d’enginyeria de proteïnes, per tal d’avaluar la síntesi de la LNT mitjançant la estratègia de transglicosidació per control cinètic utilitzant donadors glicosídics activats. S’han seleccionat i modificat aquells aminoàcids involucrats en la unió i estabilitzacions de la molècula donadora. Un cop realitzada la selecció i caracterització dels diferents mutants, el W394F – un triptòfan substituït per fenilalanina en el centre actiu de l’enzim – ha resultat el més eficaç, aconseguint un rendiment d’obtenció de LNT del 32 %, en una única etapa.

També s’han explorat altres mutacions a l’entorn del lloc d’unió de substrats mitjançant l’eina computacional BINDSCAN desenvolupada al Laboratori de Bioquímica d’IQS per assistir al disseny in silico de l’especificitat enzimàtica. Si bé l’eficiència en la síntesi de LNT és encara moderada, aquest treball obre les portes a futures investigacions que s’estan duen a terme a IQS per assolir nous biocatalitzadors per a la síntesi enzimàtica de HMO’s.

Aquesta tesi doctoral ha rebut finançament dins del projecte GLYCO2ZYMES BIO2013-49022-C2-1-R del Pla Nacional de I+D+i, Ministerio de Ciencia e Innovación d’Espanya.

Publicacions relacionades

1. Castejón, M. Faijes, A. Planas, Trasnglycosylation activity of engineered bifidobacterium lacto-N-biosidase mutants at donor subsites for lacto-N-tetraose synthesis, Int. J. Mol. Sci.2021, 22(6), 3230
2. Faijes, M. Castejón, C. Val, A. Planas, Enzymatic and cell factory approaches to the production of human milk oligosaccharides, Biotechnology Advances 37, 667–697 (2019)

Més informació
BINDSCAN, disseny assistit d’enzims